Mikroskop og celletelling

av: Dagfinn Rosnes

Hva man bør ta med i betraktningen når man skal anskaffe et mikroskop til celletelling?

Mikroskop kommer i et utall ulike typer og konfigurasjoner, og det er lett å gå seg vill i informasjonen dersom man ikke har noe å sortere den med. Pris er også en faktor som har en viss betydning for de fleste. Man får alt fra billige leketøy til noen hundrelapper, til moderne forskningsmikroskop som kan få fine biler til å fremstå som billige. Hvordan skal man gå frem for å finne et instrument som gjør jobben, og som ikke koster mer enn nødvendig? Først og fremst må man være klar over hva slags mikroskop man trenger, og hva man har behov for at det kan gjøre for deg. Kanskje er det viktig å vite hva man ikke trenger.

Mikroskop-01-Abbe

Abbe-kondenser. Iris-blenderen er ikke synlig på bildet, men sitter under kondenseren

Til telling og viabilitetstesting av gjær trenger man et biologisk mikroskop. Det finnes et utall andre typer; stereomikroskop, fluorescensmikroskop, metallurgisk mikroskop, elektronmikroskop, USB-luper etc. Til vårt formål trenger man et mikroskop som kan gjennomlyse tynne preparater under vanlig lys («brightfield microscopy»). Dette vil falle i kategorien biologisk mikroskop, og man trenger en relativt enkel konfigurasjon. Imidlertid bør man ikke falle for de billigste løsningene, da det er vesentlig at man får skikkelig optikk, og at oppløsningen er god. Mange er opptatt av hvor mye et mikroskop kan forstørre – men glemmer at det ikke nytter med stor forstørrelse hvis man ikke kan se tydelige detaljer. Høye forstørrelser er ikke nødvendigvis så viktig, og for formålet i denne artikkelen, er det lite interessant. For telling og viabilitetstesting av gjærceller bør 400x til 600x være nok. Man skal jo også kunne se tellekamrene i hemocytometret, så for stor forstørrelse er lite hensiktsmessig. Det er ikke intracellulære detaljer vi er mest opptatt av. Mange mikroskop markedsføres med hvilket forstørrelsesspekter man kan oppnå, f. eks. «40x – 2000x.» Dette sier ikke noe om kvaliteten på optikken, det mekaniske eller hvilket detaljnivå man kan se på de ulike forstørrelsene. For virkelig høye forstørrelser begynner man dessuten å slåss mot detaljer som er kortere enn bølgelengdene i det synlige lysspekteret, og dermed er det tilnærmet umulig å fremstille gode detaljer uten å gå over til andre teknikker, som elektronmikroskopi etc. Det er svært sjelden hensiktsmessig med forstørrelser over 1000x ved vanlig lysmikroskopi. Dette skal jeg kommentere ytterligere siden.

Mikroskop-02-Fasekontrastkondenser

Fasekontrastkondenser montert under objektbordet. På basen sees en «field diaphragm»

Så – hva skal man velge? En første betraktning er å ligge unna digitale mikroskop (rene digitale mikroskop, ofte markedsført som USB-mikroskop eller digital lupe, gir sjelden gode resultater, kan ha problemer med fargespekter, og har sjelden god optikk). Dernest vil jeg på det sterkeste tilråde å kjøpe et mikroskop der de enkelte komponenter kan byttes ut, og at spesifikasjonene følger internasjonale standarder (f. eks. er det greit å ha et apparat der objektivene følger RMS-standarden (RMS = «Royal Microscopic Society») for gjengedimensjoner). Når dette er etablert, kan det være greit å vite noe om hvilke deler et mikroskop er satt sammen av. De som mener seg fortrolige med dette, kan hoppe over neste avsnitt.

Et vanlig lysmikroskop består av en ramme som all optikken og tilstøtende strukturer er festet til. Nedenfra og opp består det av en lyskilde, en kondenser (som samler og konsentrerer lyset), et objektbord (der undersøkelsesobjektet anbringes), objektiver (de første forstørrelseslinsene), en tubus (røret som videreformidler lyset fra objektivet), og et okular (de øverste linsene, der man plasserer sine øyne for å se i mikroskopet). Prinsippet for enkel lysmikroskopi, er at man gjennomlyser preparatet med en konsentrert lysstråle, som føres gjennom to sett linser. Forstørrelsen er et produkt av forstørrelsen i objektivene og okularet. Et objektiv med 40x forstørrelse vil gi 400x forstørrelse hvis man benytter et okular med 10x forstørrelse. Jeg skal kort forklare hva de enkelte delene er.

Hva gjør de enkelte komponenter, og hva skal man se etter?

Mikroskop-03-Klipsholder

Klipsholder på billig og ubrukelig Billigmikroskop. Styr unna slike løsninger.

Selve mikroskoprammen, eller stativet, er den strukturelle enheten som regulerer både samspillet mellom de ulike komponentene, og utgjør festepunkter for dem. For å kunne stille inn fokus i preparatene man undersøker, må man ha et lite mekanisk drivverk som enten flytter tubus (med okular og objektiver) opp og ned i forhold til objektbordet, eller flytter objektbordet opp og ned i forhold til tubus. Slik kan man flytte brennpunktet i linsene slik at preparatet kommer i fokus. Dette gjøres med en grovskrue – som man grovstiller fokus med – og en finskrue som man fokuserer med. Det kan være avstander på mikrometernivå som avgjør hvorvidt bildet blir skarpt eller ikke, og derfor må denne mekanikken være god. Her bør man unngå apparatur med skruer og tannhjul i plast. Selve mekanismen man skrur på kan gjerne være av plast eller annet materiale, men alle mekaniske deler innenfor dette bør være av metall. Plastmekanikk vil gi problemer, og ofte fortere enn man liker. Om disse skruene flytter objektbord eller tubus spiller ingen rolle. I tillegg til denne fokuseringsmekanismen, vil rammen også være festepunkt for tubus og objektivholder, samt for lyskilden og objektbordet.

Lyskilden er uhyre viktig. I eldre mikroskop benyttet man et speil plassert under objektbordet, og var som sådan prisgitt lysstyrken i omgivelsene. Dette kan gå greit på lave forstørrelser, men jo høyere forstørrelse man benytter, jo mer lys trenger man. Å benytte et mikroskop med speil som eneste lyskilde i dag, frarådes på det sterkeste. Litt større mikroskop har gjerne separate lampehus som kan byttes ut, og monteres bak på rammen. Lyset føres da gjennom et rør, og reflekteres opp mot optikken gjennom et speil. Slike løsninger gir utvidede muligheter for å sette inn ulike filtre i lysbanen, men dette er ikke så veldig relevant her. De fleste litt rimeligere mikroskop har en lyskilde fiksert på basen, som sender lyset rett opp. Uansett hvilken løsning man faller ned på, bør lyskilden ha en regulator.

Mikroskop-04-Objektplateholder

Mekanisk objektplateholder. Still-skruene er montert på hverandre i vertikalplanet (til venstre i bildet).

Mellom lyskilden og objektbordet sitter en kondenser. Disse finnes i mange ulike typer med ulike bruksområder (fasekontrast, mørkefelt, polarisering etc), men vi ønsker til vårt formål en kondenser som samler og konsentrerer lyset slik at preparatet vi studerer blir tilstrekkelig gjennomlyst, og at objektivene får en optimal og fokusert lysstråle de kan sende videre opp til øynene som betrakter. Den justerer samtidig kontrast. En Abbe-type kondenser er det man skal se etter her. Kondenseren er utrolig viktig, og kanskje det man undervurderer aller mest som nybegynner. På litt mer avanserte mikroskop kan denne også beveges opp og ned i høydeaksen for maksimal kontroll over hvordan lyset konfigureres oppover i mikroskopets synsbane. En god kondenser skal ha en irisdiafragma på undersiden. Denne har en liten spak som regulerer hvor mye lys som slipper gjennom. Noen kondensere har også en holder for ulike typer filtre, men dette er ikke viktig for dette formålet. For full kontroll over lyset, har avanserte mikroskop også en «field diaphragm» mellom lyskilden og kondenseren. Denne gir ytterligere muligheter for å kontrollere lysstrålen opp gjennom apparatet, men den er ikke strengt tatt nødvendig.

Over kondenseren er objektbordet («the stage»). Dette er en solid plate der man plasserer preparatet man skal studere. (Preparater anbringes på en glassplate – en objektplate – med eller uten et dekkglass over. Denne platen festes så til objektbordet. For celletelling bruker man et hemocytometer, som er en spesialisert, tykk objektplate med inngraverte tellekamre). I midten har objektbordet en åpning som lyset slipper gjennom. På de aller enkleste mikroskopene festes preparatet med to klips.

Mikroskop-05-Objektiver

Objektiver montert på roterende nesestykke. Disse kan skrus av og byttes ved behov. Kjøp et mikroskop med objektiver som er gjenget etter RMS-standarden.

Dette er en løsning man skal unngå. Om man trenger å flytte preparatet i synsfeltet, har man null kontroll med en slik løsning. Her benyttes en anordning som er koblet til et mekanisk drivverk, slik at man kan flytte hele objektplaten på mikrometernivå ved hjelp av to skruer – én for x- aksen, og én for y-aksen. Selve preparatet klemmes fast i denne apparaturen, og kan dermed flyttes med stor presisjon i begge akser. Dette kalles en «mechanical stage». Her bør man også unngå plastmekanikk.

Mikroskop-06-Leitz-Wetzlarmikroskop

Leitz-Wetzlarmikroskop fra 1928. Her ser vi en klassisk tubus. Merk at eneste lyskilde er et speil. Mikroskopet har tre objektiver, kondenser (lite synlig), og mekanisk objektplateholder. Merk grov- og finskruen montert på tubus.

Over objektbordet kommer den første optikken, nemlig objektivene. Et typisk mikroskop vil ha 3-5 objektiver som er skrudd fast på en skive som kan roteres, slik at man kan velge mellom ulike forstørrelser. Et objektiv er en rørenhet med et mer eller mindre sofistikert sett med linser integrert, som gir den første forstørrelsen av preparatet. Man behøver ikke å vite så mye om hvordan disse ser ut på innsiden, men det kan være greit å vite at de sjelden har én enkelt linse, men heller flere ulike linser satt sammen for å korrigere ulike aspekter i synsfeltet. En typisk konfigurasjon består av objektiver på 4x, 10x, 40x og 100x. Dette skal kommenteres nærmere om litt.

Fra objektivet føres lyset gjennom en tubus, som er et rørstykke som er utmålt for å bringe preparatet i fokus gjennom neste sett med linser. På tradisjonelle mikroskop med ett okular er dette et tydelig rør. Det finnes imidlertid ulike konfigurasjoner som gjør at tubus ikke kan sees som noen rørstruktur. I gamle dager måtte man påse at objektivene var avstemt med lengden på tubus, men dette er ikke så aktuelt for moderne mikroskop (kjøper man et eldre mikroskop, bør man imidlertid ta dette i betraktning). I våre dager har man gjerne et hode med to eller flere okularer, som er festet til rammen. I denne formen for tubus ligger det da et prisme som splitter lyset i to like deler, slik at man kan få bildet sendt til to okularer. Her skal man bemerke at dette er en splitting av lyssignalet, og ikke to separate lyskanaler som i et stereomikroskop. Dette gir derfor ikke noen dybdevirkning i bildet, men det gjør det litt mer behagelig å jobbe når man først har vent seg til det. Det finnes ulike hoder man kan sette på toppen av rammen (og for avanserte brukere finnes det også forskjellig utstyr man kan koble mellom hodet og rammen), men det mest aktuelle her, er et binokularhode, der man får to okularer å se i. Før digitaliseringen gjorde det mulig å projisere bildet fra mikroskopet over på en skjerm, brukte man gjerne også doble binokularhoder (slik at to personer kunne se på samme preparat samtidig), eller sofistikerte løsninger med speilanordninger som tillot 4-5 eller flere binokulære stasjoner, slik at man kunne undervise grupper.

Mikroskop-07-Binokularhode

Binokularhode med dioptrisk ring. Skruen på høyre side fester hodet til rammen.

For den som er interessert i å vise frem arbeidene sine, eller eventuelt ta bilder eller video, er det mer interessant i våre dager å kjøpe et trinokularhode, der man har plass til to okularer, og en tredje kameraport, der man kan sette inn et digitalt okular som kan kobles til en skjerm. Et slikt digitalt kamera kan også settes inn i stedet for et okular, men det blir som regel mindre stabilt.

I toppen av tubus, eller hodet, sitter okularet, eller okularene. Dette er den siste linsen lyset treffer før det når betrakterens øye. Disse har typisk en forstørrelse på 10x, 15x (eller 16x), eller 20x. Det finnes okularer med mindre forstørrelse også, men disse krever spesielle kondensere for å fungere tilfredsstillende, og har ingen praktisk nytte for oss. Høyere forstørrelser er heller ikke interessante i denne sammenhengen.

Hva skal man investere i?

Ett eller to okularer, eller integrert skjerm?

Når alt dette er sagt, kan man begynne å vurdere hva slags mikroskop man skal kjøpe, og hva man bør forvente av de enkelte komponenter. Ett av de første spørsmålene man stiller seg, er kanskje hvorvidt man skal ha ett okular eller to – eller kanskje en skjerm? Når det gjelder sistnevnte, vil jeg på det sterkeste fraråde å kjøpe et mikroskop der en skjerm erstatter okularene. Dette vil føre til stor skuffelse og frustrasjon, gir ingen reell kontroll over forstørrelse, og vil slite med en mengde problemer i forhold til fargekorreksjon og fokusering. Det bør være kvalitetsoptikk hele veien til øynene. Ønsker man å kunne få bildet opp på en skjerm, bør man investere i et trinokularhode med to skikkelige okularer og et digitalt okular.

Mikroskop-08-Trinokularhode

Trinokularhode med påmontert digitalt okular som overfører bildet til en skjerm. Dette erstatter ikke å se i okularene. Dioptrisk ring på venstre side.

Dette er imidlertid ikke en erstatning for å kikke fysisk i okularene. Jeg bruker et Olympus BH2 med trinokularhode. Her kan jeg vise preparatene mine på en stor ekstern skjerm, koblet til gjennom HDMI, og jeg kan ta bilder og film med høy kvalitet, MEN – all jobbing med preparatet skjer med øynene i okularene. Selv om den digitale gjengivelsen er god, er det noe helt annet å jobbe gjennom ren optikk, og jeg opplever å ha langt dårligere bilde for detaljer hvis jeg kun ser på skjermen. Fargegjengivelsen er ikke like god, og forstørrelsen kan også avvike, samt at synsfeltet ofte er noe mindre.

Trinokularhoder er relativt dyre, og ikke egentlig noe man har bruk for i første omgang. Jeg ville anbefale et binokularhode. Det tar litt tid å venne øynene til å samle de to bildene til ett, men har man først gjort det, er det som å sykle. Det er mindre anstrengende å jobbe slik, enn å bruke ett øye i okularet og ett ut i luften (man bør ikke knipe igjen det andre øyet). Et godt binokularhode gir dessuten muligheten til å justere for synsforskjeller mellom øynene, slik at man kan få et skarpt bilde selv uten synskorreksjon (om man f. eks. bruker briller). Denne korreksjonsmekanismen kalles en «dioptrisk ring», og er en justerbar ring som sitter langs basen av en okularholder, som oftest den venstre. Se bildene over.

Objektiver og okularer

Når man har bestemt seg for om man vil ha et monokular- eller binokularhode, må man tenke på hvilke okularer man trenger. Før vi tenker på forstørrelse, må vi vite hva behovet er. Et bredt og godt synsfelt er ønskelig. Derfor skal man ta seg kostnaden med å investere i «WF-okularer.» Dette står for «Wide Field» og er helt nødvendig. Om man kjøper et gammelt brukt mikroskop, får man sannsynligvis et veldig smalt synsfelt, selv om optikken kan være veldig god. Et par 10x okularer er det jeg vil anbefale. Ønsker man en sekundær forstørrelse, er 15x et godt supplement, men disse forstørrer litt mer enn at jeg ville hatt dem som eneste konfigurasjon.

Mikroskop-09-Widefield-okularer

Widefield-okularer med 15x forstørrelse.

Objektiver er et langt mer komplisert kapittel. Disse finnes i et utall ulike forstørrelser og typer, og det er lett å gå seg vill i akromatiske, semiplan, plan, fluotar, neofluotar, fasekontrast, polariserende etc, etc. Hva har vi behov for? La oss først se på forstørrelse. Som tidligere nevnt, er en typisk konfigurasjon 4x, 10x, 40x og 100x. Det går an å spare litt penger ved å gå for tre objektiver i stedet for fire, men hva skal man velge? Som sagt, er forstørrelsen produktet av forstørrelsen i objektivene og okularene. Ovennevnte konfigurasjon vil da gi forstørrelser på 40x, 100x, 400x og 1000x hvis vi bruker 10x okularer. Med 15x okular, blir det 60x, 150x, 600x og 1500x. De høyeste forstørrelsene har man ingen nytteverdi av om man skal telle gjærceller. 100x objektiver er dessuten oljeimmersjonsobjektiver. Det betyr at man må bruke en bestemt type olje mellom preparat og objektiv for å klare å konsentrere lysstrålen (lysrefraksjonen i luft er for dårlig til å gi gode bilder ved så høye forstørrelser). Dette er beheftet med klin og plunder, og medfører at linsen må renses for hver gang. Det er vanskelig å fokusere med oljeimmersjon før man er fortrolig med det. Om man kjøper et mikroskop med immersjonsobjektiv, kommer man neppe til å bruke det. I hvert fall ikke mer enn én gang, med mindre man har interesse for andre ting enn gjær. Man kan selvsagt se bakterier på så høye forstørrelser, men uten farging er det liten nytteverdi og lite å se i dette (en fasekontrastkondenser og objektiver med fasekontrast kan gjøre dette lettere, men det er dyrt). Ønsker man fire objektiver, er det nok mer fornuftig å legge inn et 20x objektiv. De lavere forstørrelsene er ofte nødvendige for å orientere seg i preparatet før man går til høyere forstørrelser. De fleste blir overrasket over hvor lite man egentlig bruker høye forstørrelser i mikroskoparbeid. Man trenger stor nok forstørrelse til å se de detaljene man ønsker å studere, men ellers går man ikke høyere enn det. Husk at oppløsning er det aller viktigste (definert som hvilken avstand som er den minste der man kan skille mellom to punkter). Det nytter ikke med høy forstørrelse hvis man ikke klarer å skille cellene fra hverandre.

Parfokale objektiver er en fordel. Det betyr at de grovt sett beholder fokus når du endrer forstørrelse.

Mikroskop-10-Plan-objektiv

Plan-objektiv med gjenger etter RMS-standarden. Den røde streken indikerer 4x forstørrelse. Se linkene i slutten av dokumentet for en forklaring på hva de ulike tallene betyr.

Hva slags objektiver trenger man, når man har bestemt seg for hvilken forstørrelse man trenger? De fleste billige mikroskop kommer med akromatiske objektiver. Disse gir fargekorreksjon, men korrigerer ikke for linsens krumning, slik at det er vanskelig å få hele synsfeltet i fokus. Dette er et overkommelig problem, men kan føre til at man mister litt konsentrasjon hvis man må justere fokus mens man teller. For å få et flatere og skarpere synsfelt, anbefaler jeg semiplan-objektiver. Dette vil gi et langt skarpere og flatere synsfelt, og gjør det lettere å få overblikk. Det er også å anbefale om man har tenkt å fotografere noe av det man ser. Ønsker man å gå enda et hakk opp, er planobjektiver fint, men de er veldig mye dyrere, og gir ikke den helt store gevinsten for telling av gjærceller. Er man riktig snobb, kan man selvsagt investere i neofluotar-objektiver, som fort kan koste 20.000 – 30.000,- pr. stk. Det kan være store variasjoner i kvaliteten på objektiver med samme spesifikasjoner.

Objektbord, kondenser og lys

Objektbordet bør være utstyrt med en mekanisk plateholder, ellers er det ikke så mye å si om dette. Er man riktig sofistikert, kan man få kjøpt objektbord med varme, slik at levende preparater kan holdes i optimal temperatur under undersøkelsen, men dette er ikke interessant for gjærcelletelling.

Kondenseren er en meget viktig komponent. En Abbe-type fyller behovene greit (skal man opp på høye forstørrelser begynner man å møte begrensninger med en slik, men det går helt greit opp til 400x og litt til).

Lyskilden bør kunne dimmes. Et separat lampehus er fint, men sannsynligvis temmelig fordyrende. I disse dager bør man imidlertid prioritere LED-løsninger. Halogenpærer skal fases ut, og det er like greit å slippe å måtte tilpasse løsninger når den tid kommer.

Oppsummering

Jeg anbefaler på det sterkeste å gå for en løsning der man kan bytte ut og oppgradere komponenter. Dette er litt dyrere enn de billigste mikroskopene på markedet, men vil lønne seg i lengden. Fra 1500,- til 2500,- kroner får man nok brukbare mikroskop. Er man villig til å gå opp til 4000,- til 5500,- begynner det å bli bra. Det er ikke noe poeng i å overkonfigurere. Har man et apparat hvor komponenter kan byttes, kan man heller oppgradere etappevis. Jeg anbefaler et mikroskop med binokularhode, to sett okularer på 10x og 15x, tre semiplanobjektiver på 4x, 10x og 40x, mekanisk objektplateholder, abbekondenser og en regulerbar lyskilde.

De store merkene (Olympus, Leica, Zeiss, Leitz etc) lager veldig gode instrumenter – men de er også veldig, veldig dyre. Det kan være fristende å kjøpe et eldre mikroskop. Da skal man huske på at disse kan ha veldig god optikk – men synsfeltet er antagelig veldig snevert, og det er frustrerende å jobbe med. I tillegg kan det godt være at de trenger omfattende rensing. Det er ikke en jobb man bør gjøre selv, både fordi man risikerer å sette komponenter ut av nøye regulerte posisjoner, og å ødelegge overflatebehandling på linser og prismer. Dessuten kan slike gamle instrumenter ha ulike typer soppinfeksjoner i tubus og på linseoverflater. Kommersiell rensing kan være dyrt.

Man kan få gode mikroskop fra mindre aktører, f. eks. lages det en god del helt utmerkede mikroskop i India. En del av disse selges faktisk på ebay, og gjerne med gratis frakt. Se nøye på spesifikasjoner, så ender du sannsynligvis opp med et mikroskop som vil gjøre tilværelsen din enklere.

Ytterligere informasjon:

Herunder viser jeg til en del lenker som kan utdype en del aspekter av det vi har drøftet over (Jeg har ingen koblinger til Nikon, men synes disse artiklene er gode og lettfattelige):

Grunnleggende om mikroskopets oppbygning og funksjon:
https://www.microscopyu.com/microscopy-basics/components

Litt mer om oppløsning:
https://www.microscopyu.com/microscopy-basics/resolution

Om synsfeltvidde og okularer:
https://www.microscopyu.com/microscopy-basics/field-of-view

Flere detaljer om objektiver:
https://www.microscopyu.com/microscopy-basics/introduction-to-microscope-objectives
https://www.microscopyu.com/microscopy-basics/properties-of-microscope-objectives

Forklaring på hvordan objektiver er merket:
https://www.microscopyu.com/microscopy-basics/microscope-objective-specifications

Om kombinasjon av okular og objektiver, forstørrelse vs blenderåpning:
https://www.microscopyu.com/microscopy-basics/useful-magnification-range

Alle bilder i artikkelen er tatt av forfatteren, og er ikke i konflikt med noen opphavsrett.